一文了解免疫共沉澱(Co-IP)實驗原理與操作流程

類别: 新聞資訊 日期: 2025-02-25 作者: Editor
 

免疫共沉澱(Co-IP)是一種基于抗原-抗體特異性結合的蛋白質相互作用研究方法,适用于天然狀态下蛋白質複合體的驗證。

 

 

 實驗原理 

 

 

01

非變性裂解

 

使用溫和裂解緩沖液(如含1% NP-40或Triton X-100的RIPA緩沖液),保留細胞内蛋白質的天然構象及相互作用。

注:裂解液中需添加蛋白酶抑制劑(如PMSF)防止蛋白降解。

 

02

抗體靶向捕獲

 

特異性抗體與目标蛋白(如蛋白X)結合後,通過Protein A/G微珠(如瓊脂糖珠或磁珠)沉澱抗原-抗體複合物,可讓目标蛋白的互作結合蛋白Y會随複合物一同沉澱富集,得到共分離的蛋白樣本。

03

複合物檢測

 

通過Western Blot或質譜(MS)分析沉澱物中的蛋白組分,驗證相互作用。

結果示例:

 

 

 

 
 

 關鍵特點

檢測内源性相互作用(無需外源表達);

保留蛋白質翻譯後修飾狀态;

可捕獲多蛋白複合物。

 

 

 操作流程 

 

 

(以哺乳動物細胞爲例)

實驗前準備

 

 

 

實驗步驟

 

 

細胞裂解

01

收集細胞(約1×10⁷個),加入0.5-1ml預冷裂解液,冰上孵育30分鍾(注意每10min混勻一次保證細胞充分裂解),4℃ 12,000g離心15分鍾,取上清。

02

 

預清除(可選)

加入20-30μl Protein A/G珠,4℃旋轉孵育1小時,離心去除非特異結合蛋白(減少背景)。

 

抗體孵育

03

加入1-5μg特異性抗體,4℃緩慢旋轉孵育2-4h。

04

 

複合物沉澱

加入30-50μl預處理過的Protein A/G珠,4℃旋轉孵育2-4小時

 

洗滌

05

離心(3,000rpm,3分鍾)收集珠子,用預冷裂解液洗滌3次(每次1ml),去除非特異吸附。

06

 

洗脫與檢測

加入2×SDS上樣緩沖液或者Elution buffer洗脫,煮沸5分鍾,離心後取上清進行WB或質譜分析。

 

 

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