
免疫共沉澱(Co-IP)是一種基于抗原-抗體特異性結合的蛋白質相互作用研究方法,适用于天然狀态下蛋白質複合體的驗證。
實驗原理
01
非變性裂解
使用溫和裂解緩沖液(如含1% NP-40或Triton X-100的RIPA緩沖液),保留細胞内蛋白質的天然構象及相互作用。
注:裂解液中需添加蛋白酶抑制劑(如PMSF)防止蛋白降解。
02
抗體靶向捕獲
特異性抗體與目标蛋白(如蛋白X)結合後,通過Protein A/G微珠(如瓊脂糖珠或磁珠)沉澱抗原-抗體複合物,可讓目标蛋白的互作結合蛋白Y會随複合物一同沉澱富集,得到共分離的蛋白樣本。
03
複合物檢測
通過Western Blot或質譜(MS)分析沉澱物中的蛋白組分,驗證相互作用。
結果示例:
關鍵特點
檢測内源性相互作用(無需外源表達);
保留蛋白質翻譯後修飾狀态;
可捕獲多蛋白複合物。
操作流程
(以哺乳動物細胞爲例)
實驗前準備
實驗步驟
細胞裂解
01
收集細胞(約1×10⁷個),加入0.5-1ml預冷裂解液,冰上孵育30分鍾(注意每10min混勻一次保證細胞充分裂解),4℃ 12,000g離心15分鍾,取上清。
02
預清除(可選)
加入20-30μl Protein A/G珠,4℃旋轉孵育1小時,離心去除非特異結合蛋白(減少背景)。
抗體孵育
03
加入1-5μg特異性抗體,4℃緩慢旋轉孵育2-4h。
04
複合物沉澱
加入30-50μl預處理過的Protein A/G珠,4℃旋轉孵育2-4小時。
洗滌
05
離心(3,000rpm,3分鍾)收集珠子,用預冷裂解液洗滌3次(每次1ml),去除非特異吸附。
06
洗脫與檢測
加入2×SDS上樣緩沖液或者Elution buffer洗脫,煮沸5分鍾,離心後取上清進行WB或質譜分析。
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